根据“全球疾病负担研究”2019年公布的数据，我国脑出血发病率约为44.6/10万，占全部脑卒中类型的1/4，病残率和病死率较高。尽管长期以来有众多学者致力于脑出血治疗的基础或临床研究，但迄今仍未发现能够显著改善预后的有效方法。有研究显示，脑出血后30天死亡率为50%，生存者中约80%生活无法自理。因此，减轻脑出血继发性损伤、改善预后仍是当下关注的重点课题之一。

        针对脑出血继发性损伤发生机制的研究表明，炎症、氧化应激、血液内容物(血红蛋白、凝血酶)等引起的细胞毒性作用是继发性脑损伤的主要病理生理学机制，其中以氧化应激机制颇受关注。核因子E2相关因子2(Nrf2)是一种重要的氧化还原敏感性转录因子，在调节氧化还原平衡、维持细胞氧化还原稳态中发挥关键作用，是目前脑出血后抗氧化应激治疗研究的热点。本文拟对Nrf2调控氧化应激和参与脑出血继发性损伤机制的研究进展进行综述，以期为脑出血治疗提供新的思路。

1.Nrf2结构

        1994年Moi等首次在K562细胞中克隆出一种具有转录活性的蛋白质即Nrf2，并发现其可作为碱性亮氨酸拉链的转录活化因子，结合于β-珠蛋白基因启动子NF-E2/AP1基因重复片段上。1997年，Itoh等首次证实Nrf2对Ⅱ期药物代谢酶(phaseⅡdrugmetabolizingenzyme)基因(如GST、NQO1基因)的转录诱导是不可或缺的。

        近年来，有关Nrf2的研究取得突破性进展，业已证实，Nrf2可调控大量由抗氧化反应元件(ARE)控制的基因(GST、NQO1基因等)，在应对内源性或外源性氧化应激反应中均发挥重要作用。Nrf2是cap'n'collar(CNC)转录因子家族成员之一，共包含7个(Neh1~7)Nrf2-ECH同源功能结构域，每一结构域均有其特殊功能。

        Neh1结构域位于Nrf2羧基末端(C-端)中部，包含CNC碱性区域亮氨酸拉链(CNC-bZIP)区域，具有DNA结合基序，可以与细胞核内小Maf蛋白(sMaf)结合形成二聚体，使Nrf2结合到DNA上。Neh2结构域位于Nrf2氨基末端(N-端)，含有两个降解因子ETGE和DLG基序，这两个基序可与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)结合，负责细胞质中Nrf2的泛素化调控。Neh3结构域亦位于Nrf2的C-端，可通过招募染色质域解旋酶DNA结合蛋白6(CHD6)反式激活Nrf2，上调其靶基因表达。

        Neh4和Neh5结构域主要通过招募CREB结合蛋白(CBP)参与调控Nrf2转录活性。Neh6结构域内含有DSGIS和DSAPGS基序，主要通过招募β-转导重复相容蛋白(β-rCP)介导Nrf2的降解，进而实现Nrf2的负向调控。Neh7结构域则与视黄酸受体α(RXRα)相互作用，下调Nrf2靶基因的表达。

2.Nrf2调控途径

        Nrf2的调控途径主要分为两种模式，依赖Keap1蛋白的Nrf2泛素化降解模式和不依赖Keap1蛋白的Nrf2调控模式，后者包括Nrf2磷酸化和乙酰化等。

        2.1依赖Keap1蛋白的Nrf2泛素化降解

        在生理状况下，Nrf2的泛素化降解主要依赖Cullin3泛素连接酶底物适配蛋白Keap1蛋白，后者形成二聚体并与Nrf2上的ETGE和DLG基序结合，之后26S蛋白酶通过定位ETGE和DLG基序将Nrf2泛素化并降解。

        Keap1蛋白通过上述方式结合细胞质中的Nrf2并使其维持在一个相对低水平，在氧化应激状态下，Keap1蛋白与Nrf2的结合受到影响，Nrf2的泛素化水平下降，在细胞质中聚集增多的Nrf2可进入细胞核调控靶基因的表达。Keap1蛋白中负责感受外界氧化应激反应的半胱氨酸残基，包括Cys151、Cys273和Cys288，其中Cys151位于Keap1蛋白的BTB结构域，Cys273和Cys288位于干预区(IVR)结构域，上述半胱氨酸残基被氧化或化学修饰后，可干扰Keap1蛋白与Cullin3的结合，进而抑制Nrf2的泛素化降解，促进Nrf2的聚积，导致下游靶基因表达上调。

        2.2不依赖Keap1蛋白的Nrf2调控

        除上述经典的依赖Keap1蛋白的Nrf2调控途径外，还包括Nrf2磷酸化和乙酰化等模式。Nrf2有数个位点可供磷酸化，如糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)、蛋白激酶C(PKC)等均可通过Nrf2磷酸化以实现对其泛素化降解或调控其在细胞核内的聚积等。

        GSK-3β是一种广泛分布于各类细胞的丝氨酸/苏氨酸激酶，可使Neh6结构域DSGIS基序中的Ser335和Ser338残基磷酸化，从而促进Neh6结构域与β-rCP的结合，介导非Keap1蛋白依赖的Nrf2泛素化降解。AMPK则可以通过Nrf2的Ser550残基磷酸化而促进Nrf2在细胞核内的聚积，并上调靶基因的表达;另外，AMPK还可以通过抑制GSK-3β的表达而间接抑制Nrf2的泛素化降解。

        PKC对Nrf2的调控主要通过Neh2结构域上的Ser40残基磷酸化实现，经磷酸化的Ser40残基具有促进Nrf2与Keap1蛋白解离的作用，以此减少Nrf2泛素化降解，但PKC并不影响Nrf2移位至细胞核内，亦不影响其结合DNA的能力。此外，乙酰化同样具有调控Nrf2的作用，有研究显示，组蛋白乙酰转移酶P300可以使Nrf2直接乙酰化，并以此增强Nrf2与DNA的结合能力，从而上调下游靶基因的表达。

3.Nrf2在脑出血继发性损伤中的作用机制

        3.1抗氧化应激

        2007年，Wang等首次采用胶原酶脑出血小鼠模型观察Nrf2在氧化应激中的作用，结果显示，与野生型小鼠相比，Nrf2基因敲除小鼠脑出血后神经功能缺损程度更为严重，且在应激过程中白细胞浸润性炎症反应更明显、活性氧(ROS)“产量”更大，提示Nrf2可通过减轻白细胞介导的自由基氧化损伤以减轻脑出血继发性损伤。

        同年，一项针对SD大鼠及C57BL/6小鼠自体血脑出血模型的研究发现，Nrf2激动剂萝卜硫素具有改善大鼠及小鼠脑出血后(10天)神经功能缺损症状的作用;Westernblotting法检测提示，萝卜硫素可以显著上调血肿周围脑组织细胞核内Nrf2的表达水平，并可使受Nrf2调控的下游抗氧化酶如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(SOD)、NQO1和GSTmRNA的表达水平升高，而氧化应激损伤标志物3-硝基络氨酸(3-NT)和4-羟基壬烯醛(4-HNE)表达水平降低。

        另一方面，相较于野生型小鼠，Nrf2基因敲除小鼠脑出血后神经功能缺损程度更明显，且萝卜硫素治疗无效。以上研究结果提示，萝卜硫素可通过激活Nrf2发挥其抗氧化应激作用、降低氧化应激损伤，进而实现脑保护作用。通过体内外实验发现，Nrf2激动剂RS9可通过上调SOD表达水平而减少ROS生成，减轻脑水肿并改善神经功能。

        除直接激活Nrf2提升抗氧化能力以实现脑出血后的脑保护作用外，亦可通过其他通路间接调控脑出血后Nrf2的表达变化，以减轻氧化应激损伤。

        (1)经侧脑室促黑素细胞激素类似物NDP-MSH，通过激活PI3K/Akt/Nrf2信号转导通路减轻小鼠脑出血后氧化应激、减少神经元凋亡。

        (2)木犀草素通过激活P62/Keap1/Nrf2信号转导通路促进脑出血后自噬，减轻氧化应激损伤。

        (3)富马酸单甲酯具有激活miRNA-139/Nrf2信号转导通路的作用，从而抑制脑出血后炎症反应和氧化应激损伤。

        (4)胃饥饿素、异甘草素等也可通过间接调控Nrf2或其所在通路减轻氧化应激，降低继发性损伤，实现脑保护。

        (5)脑出血后血红蛋白降解产生的血红素可诱导ROS生成，导致氧化应激损伤;而血红素氧化酶-1(HO-1)既是血红素降解的重要限速酶，同时也是受Nrf2调控的下游抗氧化酶之一，在氧化应激情况下，通过Nrf2调控的转录激活，使HO-1表达水平上调。

        研究显示，星形胶质细胞特异性过表达HO-1有脑保护作用，经血红蛋白预处理的星形胶质细胞可诱导Nrf2表达上调并促进其转移进入细胞核，进而上调HO-1表达水平，降低血红素引起的星形胶质细胞ROS生成和细胞凋亡。

        (6)体外实验发现，褪黑素可通过PKCα/Nrf2/HO-信号转导通路减轻血红素对星形胶质细胞的毒性作用。

        (7)原儿茶酸、骨髓间充质干细胞、烟酰胺单核苷酸等也可通过调控Nrf2/HO-1信号转导通路减轻氧化应激损伤，改善神经功能缺损程度。上述体内外研究表明，Nrf2/HO-1信号转导通路可能是潜在的抗氧化应激治疗靶点。

        3.2促进血肿清除

        Nrf2除抗氧化应激作用外，还具有促进细胞吞噬作用。Nrf2激动剂RS9可促进视网膜色素细胞的吞噬功能，并改善受损的肺泡巨噬细胞吞噬能力。2015年，Zhao等的体外实验发现，Nrf2激动剂萝卜硫素不仅可增强小胶质细胞吞噬红细胞的能力，同时还可使Nrf2蛋白快速进入小胶质细胞胞核，增强Nrf2与DNA的结合能力，进而增加下游抗氧化相关酶包括GST、SOD1、NQO1等的表达，此外，通过上调介导吞噬的清道夫受体CD36的表达，首次证实Nrf2具有促进血肿清除的作用。该项研究还发现，脑出血后第7天，具有吞噬作用的小胶质细胞主要集中在血肿周围，经萝卜硫素治疗后血肿体积明显减小。

        为证明Nrf2在血肿清除中的作用，进一步构建Nrf2基因敲除小鼠脑出血模型，该模型与野生型小鼠相比，血肿吸收时间明显延迟，且萝卜硫素治疗未显示出促进血肿吸收之功效。推测Nrf2可能通过CD36促进小胶质细胞吞噬，进而促进血肿清除。此外，红曲素、重组CCL17等药物也可通过上调Nrf2表达促进血肿清除，改善小鼠神经功能预后。

        目前针对脑出血的临床治疗手段较少，因此关于脑出血后继发性损伤机制和脑保护策略的研究仍是基础研究的热点。Nrf2激动剂和相关天然抗氧化提取物具有减轻脑出血后氧化应激反应、改善继发性损伤作用，可实现脑保护目的，而且在血肿清除过程中亦扮演重要角色。因此，Nrf2有望成为减轻脑出血后继发性损伤的治疗靶点，相关研究结果亦为后期临床试验及临床转化提供了理论依据。

        来源：徐伟,谢之易,王泽旭,马潞,游潮,胡鑫.核因子E2相关因子2对脑出血继发性损伤调控机制研究进展[J].中国现代神经疾病杂志,2022,22(10):836-840.