神经外科

EGLN家族在胶质瘤中的研究进展

作者:佚名 来源:MedSci梅斯 日期:2021-12-01
导读

         胶质瘤是神经上皮组织来源的肿瘤的总称,是中枢神经系统发病率最高、恶性程度最高的原发性肿瘤。成人胶质瘤的发病率约为8/10万,占颅内肿瘤的40%~50%,5年存活率为20%~30%。其中,胶质母细胞瘤是一种侵袭性极高且生长迅速的恶性肿瘤,患者确诊后平均生存期约14个月,2年生存率仅26%。 目前,胶质瘤的发病机制尚未明确。胶质瘤发展初期就向周围瘤旁组织侵袭性生长,术后容易复发是影响其临床疗效的主要

关键字:  胶质瘤 

        胶质瘤是神经上皮组织来源的肿瘤的总称,是中枢神经系统发病率最高、恶性程度最高的原发性肿瘤。成人胶质瘤的发病率约为8/10万,占颅内肿瘤的40%~50%,5年存活率为20%~30%。其中,胶质母细胞瘤是一种侵袭性极高且生长迅速的恶性肿瘤,患者确诊后平均生存期约14个月,2年生存率仅26%。

        目前,胶质瘤的发病机制尚未明确。胶质瘤发展初期就向周围瘤旁组织侵袭性生长,术后容易复发是影响其临床疗效的主要因素。胶质瘤现有的治疗方法是集手术、放疗和化疗于一体的个体化治疗,但对病理级别较高的胶质瘤的疗效不够理想。因此,从分子及细胞水平探讨胶质瘤的发生和发展机制,有助于进一步研究其分子生物学特性,从而更好地指导临床诊治。

        有研究表明,人脯氨酰羟化酶(EGLN)家族成员在胶质瘤中充当缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)的保护性负反馈调节剂,通过诱导细胞凋亡信号的传导,对神经胶质瘤起到潜在的调节作用。还有研究通过探讨动物模型中胶质瘤的进展过程,发现EGLN3 可能降低胶质瘤进展的动力学并提高存活率。

1.EGLN家族的发现和分子结构特征

        EGLNs是一类由蛋白二硫化物异构酶亚单位和羟化酶单位组成的四聚体,是依赖氧气、亚铁离子和α-酮戊二酸的双加氧酶超家族成员。迄今发现的EGLNs 主要有4 种,包括EGLN1、EGLN2、EGLN3、EGLN4,它们分别又可被称为PHD2、PHD1、PHD3、PHD4/EGL9 或HPH2、HPH3、HPH1、HPH4。

        目前的研究热点主要集中于前三种,不同EGLNs在组织中的表达均有差异。EGLN1 mRNA 表达于多种组织的细胞核,尤其高表达于睾丸和胎盘;EGLN2 mRNA广泛表达于细胞质,尤其高表达于脂肪组织;EGLN3 mRNA则在细胞质与细胞核中均有表达,在胎盘和心脏中表达水平较高,但相对于EGLN1和EGLN2,其表达水平较低;EGLN4表达于内质网膜,在细胞管腔里有活性位点。

        EGLNs发挥酶的作用需要底物氧分子作为协同,通过与两个氧分子的一系列生化反应,发生去碳羧基反应和脯氨酰羟化反应。

2.EGLN 家族的生理功能

        EGLN家族成员均可使HIF氨基端的ODD区脯氨酸残基发生羟基化反应。作为氧传感器,在常氧状态下,EGLNs可诱导HIF活化,进而发生羟基化共价修饰其氧依赖降解域——核心脯氨酸。但研究发现,不同亚型EGLNs对不同亚型HIF-α的诱导活性亦存在一定差异。

        2.1 EGLN1

        常氧状态下,EGLN1对HIF-2α的影响大于HIF-1α。EGLN1 被沉默可表现为节氧表型,主要原因是其氧化产能由三羧酸循环转变为糖酵解。而在低氧状态下,EGLN1不会被活化,故活性不受影响,不再发生翻译后修饰,HIF1α因未被降解而活性增强,促进靶基因的转录。有研究表明,EGLN1基因沉默可使小鼠细胞中的氧化磷酸化反应转变成糖酵解,使葡萄糖的利用率下降,导致小鼠骨骼肌运动能力减弱。EGLN1还可作用于细胞有丝分裂,进而影响细胞周期。

        2.2 EGLN2

        常氧状态下,EGLN2对HIF-1α的影响大于HIF-2α。EGLN2在羟基化反应中的影响最大(EGLN2>EGLN3>EGLN1),沉默其表达后可导致血清促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达上调、红细胞生成增加、血管生成增多;完全沉默其表达可使胚胎无法发育,甚至死亡。而在低氧状态下,EGLN2因低氧诱导而活性增强,表达水平显著升高。

        组织中不断蓄积的HIF1α会反射性激活EGLN2,EGLN2 启动子区含有直接受HIF调控的靶基因结合区,二者存在负反馈调节机制。EGLN2的催化结构——N末端有一个特有的锌指结构,同源存在于线虫的EGL-9中,而EGLN3和EGLN1中未发现该锌指结构的存在。EGLN2可通过影响HIF1抑制促炎因子的表达及炎症细胞的聚集,进而保护内皮细胞免受缺血再灌注损伤。

        2.3 EGLN3

        常氧状态下,EGLN3对HIF-1α的影响与HIF-2α相同。EGLN3被沉默可导致静息血压降低和神经支配发生独特的变化。在对哺乳动物的研究中发现,低氧状态下EGLN3因低氧诱导而活性增强,可通过一种非von Hipplel-Lindau(VHL)泛素连接酶相关途径使转录激活子4(activating transcription factor 4,ATF4)表达上调,进而诱导细胞凋亡。

        EGLN3可调节肿瘤细胞的葡萄糖代谢和乳酸生成,参与丙酮酸在线粒体内的氧化,影响丙酮酸与乳酸之间的转化,在维持细胞糖酵解和蛋白合成等功能中发挥重要作用。EGLN3能够通过磷酸化作用缩短细胞半衰期,进而影响细胞的增殖周期。此外,EGLN3对调节血糖和脂质代谢也有间接作用。

        2.4 EGLN4

        常氧状态下,EGLN4对HIF-2α的影响大于HIF-1α,EGLN4仅在HIF-1α过表达时发挥调节作用,且在人体组织和各类型肿瘤中均有表达。EGLN4 过表达可降低HIF-2α 蛋白表达水平,进而抑制体内肿瘤的生长。但有研究发现,EGLN4过表达虽然可抑制肿瘤的生长,但肿瘤血管数量却有所增加,这一点有别于EGLN1-3抑制肿瘤血管生成的功能。通过向骨肉瘤模型内注射荧光染料分析肿瘤组织灌注结果,发现虽然骨肉瘤中EGLN4过表达可促进肿瘤血管生成,但大部分为无功能性血管,并且由于EGLN4对HIF-1α的影响较小,不影响VEGF的表达。

        EGLN家族不同成员对血管生成通路有着不同的影响,整体上发挥着调节血管生成平衡的作用。EGLNs 不同亚型对HIF1α 不同脯氨酸位点的羟基化作用也存在一定差异。其中,EGLN1、EGLN2、EGLG3均可羟基化HIF-1α的Pro564位点,但只有EGLN2 和EGLG1 可羟基化Pro402 位点,且EGLN2和EGLN1 两个脯氨酸位点多肽的Km 值也存在差异。

3.EGLN 家族的表达和活性调节

        EGLN家族的表达和活性在多个水平上受到调控,主要包括需氧的HIF反应调节通路、不需氧的HIF反应调节通路和生理因素诱导通路。EGLNs与HIFs之间构成一个有效的负反应调节系统。有研究采用质谱分析法发现泛素E3 连接酶Siah1 和Siah2可降解EGLN1和EGLN3,但无法降解EGLN2。此外,许多生理因素也会影响EGLNs的表达,如神经生长因子和p53。

        研究表明,EGLNs的活性还受到多种因素的调节,包括氧自由基、二价金属离子、抗坏血酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、一氧化氮(NO)、HIF羟化酶相关蛋白、胰岛素、钙离子螯合剂等。EGLN家族与HIFs反应调节通路是目前研究最广泛的通路。

4.EGLN 家族与肿瘤

        近年来研究表明,EGLN家族的表达和功能受到越来越多的重视。尤其在肿瘤领域,EGLN家族在肿瘤增殖和分化过程中发挥着重要作用,目前公认的影响HIFs调控转录的表达是一个较有研究意义的方向。

        在人实体肿瘤中均存在氧含量不足的区域,机体对缺氧环境的适应大多由HIFs介导,如HIIF-1a、HIF-2a、螺旋-环-螺旋PAS结构域转录。这些转录因子的调节作用涉及细胞增殖、代谢基因的表达及血管生成和扩展。EGLNs可直接感受氧分压的变化,在缺氧状态下通过调节HIFs的表达并改变其稳定性影响部分基因的表达,其“缺氧效应”可促进肿瘤中癌基因的活化及抑癌基因的沉默。

        多项研究表明,EGLN家族在肺癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、食管癌等实体肿瘤中均有表达。在肺癌相关研究中发现,EGN3过表达可明显抑制肺癌细胞的活性及侵袭、迁移能力;Durczak等研究表明,上调宫颈癌细胞株中EGLN2 的表达,可使外显子“CpG 岛”彻底脱甲基化,从而达到治疗宫颈癌的目的;结肠癌组织中EGLN3表达下调与肿瘤病理分期升高和远处转移密切相关,上调EGLN1的表达可增强结肠癌细胞对化疗的敏感性,并抑制其生长。

        有研究发现,肾癌患者血清抗EGLN3抗体水平明显高于健康对照组,有望用于鉴别肾脏肿瘤的良恶性。EGLN3已被初步证实为肾透明细胞癌转移生物标志物的最强候选者之一。EGLN3高表达可能有助于提高胰腺癌的放疗效果,或许能够成为评估胰腺癌放疗效果的靶向标志物。

        有研究表明,EGLN3可影响乳腺癌细胞的去分化,其表达水平与乳腺癌的分期、肿瘤体积和预后有关。在高分化肝细胞癌中,EGLN阳性表达率约为47%,与HIF-lα蛋白无明显差异,但在分化较差的肝癌中表达明显升高,与肿瘤直径和是否侵犯血管或转移有较大关系,且EGLN3表达水平与肿瘤直径呈负相关。在食管癌大鼠模型的研究中,通过基因测序发现EGLN3为核因子b的副调节因子,可与mir-31建立功能联系,与缺锌mir-31野生型实验组比较,EGLN3表达下调可导致大鼠基因体不稳定和代谢活动改变。

 

5.EGLN家族与胶质瘤

        Henze 等发现,在胶质母细胞瘤中EGLN2 和ENLN3可在体外被低氧诱导,并在体内肿瘤的低氧区域表达。在一组人胶质母细胞瘤细胞系中,EGLN1-4的mRNA表达水平相差数十倍,缺氧条件下EGLN2 和EGLN3 表达显著增加,其中EGLN3 表现出极强的诱导能力。进一步基因过表达和沉默实验结果显示,上调EGLNs表达可弥补因HIFs调节而减少的氧气供应,EGLN2受HIF-1α控制,而EGLN3是HIF-1α和HIF-2α的转录靶点。

        此外,抑制EGLNs表达可促进星形孢菌素和肿瘤坏死因子诱导的细胞凋亡,表明EGLN家族具有保护细胞活力的作用。EGLN/HIF 调节轴可能成为一种新型治疗靶点,用于克服胶质母细胞瘤的死亡抵抗。Sciorra 等通过研究大鼠模型中EGLN3 表达对神经胶质瘤进展的影响,首次证明EGLN3足以影响神经胶质瘤进展的动力学,并提高大鼠的存活率。

        向大鼠模型颅内胶质瘤细胞中注射EGLN3并诱导其表达时,肿瘤的侵袭性降低,大鼠的存活率明显增加;进一步比较大鼠胶质瘤细胞和大鼠神经干细胞中EGLNs的表达发现,缺氧状态下EGLN1在大鼠胶质瘤细胞和神经干细胞中的转录水平均显著升高,但EGLN2 的转录水平未见明显变化。

        此外,在常氧和缺氧状态下,大鼠胶质瘤细胞中均未检测到EGLN3,而在大鼠神经干细胞中,EGLN3在低氧状态下的表达显著上调。研究还发现,Klf5(一种调节血管重塑的重要转录因子)的表达与EGLN3的相对缺失和HIF-2α的存在相关,其在大鼠神经干细胞中未被检测到,而在大鼠胶质瘤细胞中表达上调,但Klf5与EGLN3的具体机制尚未明确。

        缺氧状态下,人神经胶质瘤U87细胞中HIF-2α和Klf5表达上调,表明Klf5在神经胶质瘤中介导了某些HIF依赖的下游功能。HIFs参与OCT4基因转录试验结果表明,EGLN3 可抑制肿瘤细胞中Klf5、OCT4 和VEGF的表达,在大鼠胶质瘤细胞中用阿霉素诱导EGLN3表达后,VEGF的表达减少了80%、Klf5的表达减少了90%、OCT4的表达减少了90%。

        此外,EGLN3表达上调可使胶质瘤毛细血管结构趋于正常化,EGLN3通过HIFs羟基化和参与非羟化酶依赖的信号通路,在神经胶质瘤进展中发挥关键作用。Mao等建立了低级别胶质瘤小鼠模型,采用免疫组织化学法和免疫印迹分析发现,EGLN3在胶质瘤组织中的表达过程中通过增加DNA片段来增强肿瘤细胞的凋亡信号。

        进一步通过解剖被神经胶质瘤诱导和被α-酮戊二酸辅助因子拮抗剂、HIF抑制剂(DMOG)抑制EGLN3 表达的小鼠脑组织样本,发现正常小鼠大脑组织中细胞增殖分布均匀,而神经胶质瘤诱导的组织中细胞增殖差异较大,从而证明小鼠低级别胶质瘤模型的成功建立。

        继而在EGLN3 与细胞凋亡信号的相关性评估中发现,EGLN3在神经胶质瘤初始阶段表达上调,肿瘤细胞凋亡信号增强,应用DMOG后可有效抑制EGLN3的表达,提示EGLN3通过触发异常细胞中的凋亡信号来调节早期神经胶质瘤。此外,Western blotting结果显示,随着EGLN3表达上调,凋亡信号明显增加,且在EGLN3 抑制剂的作用下,细胞内凋亡信号与EGLN3的表达模式存在显著差异。

6.EGLN 家族在胶质瘤治疗中的潜在意义

        存在低氧区域是恶性肿瘤的常见表现,可使肿瘤细胞浸润生长和转移风险增加,是恶性肿瘤治疗效果差的影响因素。近年来,研究者在各种动物模型和细胞中均观察到了EGLN家族的缺氧诱导性,并提出许多有关在生理和病理条件下缺氧导致EGLN水平升高的生物作用等问题。有研究显示,EGLN家族蛋白在不同神经胶质瘤细胞系的体外表达水平存在差异。

        Henze等研究发现,在胶质母细胞瘤活检的坏死区域可检测到EGLN2、EGLN3。与体内EGLN2 和EGLN3 的负反馈调节功能一致,EGLN2存在于肿瘤细胞的细胞核及细胞质,而EGLN3主要表达于细胞质,在肿瘤组织氧可利用性降低的区域内,EGLN2和EGLN3的mRNA和蛋白表达均明显上调,表明体内缺氧是EGLNs表达的强效诱导因素。但EGLN1和EGLN4蛋白表达在缺氧区域未见明显上调。

        胶质母细胞瘤中的EGLNs主要起负反馈调节作用,在氧气供应减少时可影响HIF反应,EGLN1-4均可有效降低HIF蛋白水平和HIF反式激活活性,即使在氧气含量低至1%的情况下亦是如此。此外,EGLNs还可通过细胞应激激活使细胞对凋亡诱导更加敏感,表明EGLNs或许能够减弱胶质母细胞瘤细胞的死亡抵抗。

        Mao等通过小鼠模型证明了低级别神经胶质瘤中EGLN3的表达水平与凋亡信号有关,加入EGLN3抑制剂可使胶质瘤组织的凋亡信号显著降低,从而诱导肿瘤细胞增殖。

7.结语与展望

        综上所述,EGLN家族作为氧分压感受器,可通过调节HIFs通路激活一系列靶基因,影响肿瘤细胞的增殖和分化。随着对EGLN 家族的研究更加深入,其与胶质瘤之间的关系也将更加清晰,与HIFs的相互作用机制也必将更加透彻,且多数学者认为临床胶质细胞瘤疗效差的主要原因是肿瘤细胞的死亡抵抗。

        通过上调EGLNs的表达促进HIFs降解,在治疗缺氧相关疾病方面已取得一定的进展。通过药理学途径诱导激活EGLNs或增强其活性来抑制HIFs相关因子的表达,进而减弱肿瘤细胞的死亡抵抗,是未来值得研究的方向。此外,EGLN家族在基因工程领域也有着广阔的前景,但遗憾的是,关于EGLN家族对人胶质瘤治疗药物研发或基因靶向的实质性研究进展,国内外目前均未见报道。

        相信随着胶质瘤治疗思路的不断改进、对胶质瘤细胞培养及动物模型中EGLN基因表达和细胞凋亡等的研究,以及基础医学和药理学研究的不断深入,EGLN靶点检测有可能成为胶质瘤临床防治、延缓肿瘤侵袭、评估肿瘤转归和复发概率的参考指标之一,有望在防治胶质细胞瘤及改善患者预后方面发挥一定的临床参考价值。

        来源:何伟波,何正文.EGLN家族在胶质瘤中的研究进展[J].肿瘤药学,2021,11(04):432-437.

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